In-Cell Western 免疫熒光定量分析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

In-Cell Western（ICW）是一種用于定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量或信號(hào)傳導(dǎo)的方法，既簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)高效。ICW檢測(cè)方法將細(xì)胞接種在微孔板中，然后進(jìn)行固定/通透化，利用特異性一抗，紅外染料偶聯(lián)的二抗體進(jìn)行標(biāo)記。通過Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)獲取熒光信號(hào)，可以精確測(cè)量細(xì)胞信號(hào)通路的誘導(dǎo)或抑制，并能夠在單個(gè)孔板上進(jìn)行多種處理和多次重復(fù)。 

ICW技術(shù)中免疫熒光檢測(cè)

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，尤其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和磷酸化蛋白的分析中，蛋白表達(dá)水平的量化越來越重要。這些研究中通常需要分析許多樣品，密切的檢查信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的事件，并評(píng)估各種實(shí)驗(yàn)條件。In-Cell Western（ICW）定量免疫熒光測(cè)定法，簡(jiǎn)化的實(shí)驗(yàn)流程，可以并行處理并檢測(cè)多個(gè)試驗(yàn)樣品，高通量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序和數(shù)據(jù)分析。微孔板檢測(cè)將Western Blot的特異性與ELISA的重現(xiàn)性、高通量相結(jié)合，能夠有效的定量多個(gè)樣品中相對(duì)蛋白水平和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。In-Cell Western技術(shù)也被稱為cytoblots（細(xì)胞印跡），細(xì)胞ELISA（cLISA），細(xì)胞內(nèi)ELISA（ICE）或FACE（基于快速激活的細(xì)胞ELISA）。

圖1. ICW技術(shù)示意圖。在96孔板或384孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，并進(jìn)行固定和通透處理，再通過IRDye偶聯(lián)的二抗，通過免疫熒光檢測(cè)靶蛋白的熒光信號(hào)，對(duì)微孔板進(jìn)行成像并量化信號(hào)強(qiáng)度。

     ICW技術(shù)基于標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光技術(shù)，二抗中標(biāo)記了近紅外熒光染料，兩種NIR熒光染料能夠被檢測(cè)器檢測(cè)，提供雙通道檢測(cè)信號(hào)，使用Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)（Azure Biosystems）對(duì)每個(gè)孔中細(xì)胞群體的熒光信號(hào)成像，得到檢測(cè)結(jié)果。ICW使用近紅外的原因是，在近紅外波長范圍中，塑料，細(xì)胞，化學(xué)試劑的自發(fā)熒光背景很低，背景值遠(yuǎn)低于可見光波長范圍。因此定量Western檢測(cè)中，非常適合使用近紅外波長進(jìn)行檢測(cè)。

ICW檢測(cè)可以使用3種熒光通道進(jìn)行檢測(cè)，一種可見光熒光通道可用于針對(duì)細(xì)胞染色或總蛋白染色進(jìn)行歸一化（normalize），以通過校正孔與孔之間細(xì)胞數(shù)的差異來提高準(zhǔn)確性。被研究的兩種靶蛋白使用2個(gè)近紅外熒光通道進(jìn)行檢測(cè)，類似于近紅外熒光Western Blot，可以同時(shí)檢測(cè)兩種目的蛋白。對(duì)于磷酸化蛋白分析，一個(gè)紅外通道檢測(cè)靶蛋白，另一個(gè)紅外通道檢測(cè)磷酸化靶蛋白。

圖2：ERK的磷酸化對(duì)信號(hào)通路刺激的響應(yīng)。 用EGF刺激A431細(xì)胞。 （a）用磷酸-ERK抗體（綠色； 800nm）檢測(cè)到ERK磷酸化。 還檢測(cè)到每個(gè)孔中的ERK總水平（紅色； 700 nm）。 重疊圖像中的黃色表示700和800 nm信號(hào)重疊。 在96孔板的一部分中顯示了兩排孔。 （b）熒光定量。 將磷酸ERK信號(hào)相對(duì)于總ERK信號(hào)進(jìn)行歸一化，以校正細(xì)胞數(shù)之間的差異。 與靜止?fàn)顟B(tài)相比，EGF刺激的細(xì)胞顯示ERK磷酸化增加> 16倍。

轉(zhuǎn)載自：Analytical Biochemistry 338：136–142.

Western Blot的替代方法

ICW檢測(cè)可以作為Western Blot（WB）的替代方法。在ICW檢測(cè)中，數(shù)百種樣品能夠被快速檢測(cè)，靶蛋白在固定的細(xì)胞中進(jìn)行原位檢測(cè)，輸出高精度、量化數(shù)據(jù)結(jié)果。而在WB檢測(cè)中，蛋白經(jīng)歷了細(xì)胞裂解，電泳和膜轉(zhuǎn)移步驟，這些步驟費(fèi)時(shí)費(fèi)事，而且引入很多變量降低了檢測(cè)精度。在微孔板中，少量固定劑就能夠終止細(xì)胞活動(dòng)，保存細(xì)胞內(nèi)容物。ICW能夠均勻、精確的終止實(shí)驗(yàn)反應(yīng)；隨著時(shí)間的推移，動(dòng)態(tài)分析細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，并且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更好。由于實(shí)驗(yàn)過程中引入的變量減少，ICW分析的標(biāo)準(zhǔn)差低于Western印跡（圖3；WB分析的CV = 0.27； ICW分析的CV = 0.08-0.16）。 WB的變異性和誤差增加可能會(huì)掩蓋蛋白質(zhì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化，而這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)變化能被ICW捕捉到。

圖3. WB和ICW分析中的變異性比較。 用催產(chǎn)素刺激子宮肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 然后使用WB和ICW分析，在重復(fù)樣品中檢測(cè)GAPDH和PMLC 20的水平。 （a）將兩個(gè)相同的蛋白質(zhì)印跡的條帶強(qiáng)度繪制為兩個(gè)印跡中每個(gè)印跡的13個(gè)樣品的平均值的比例（印跡1為藍(lán)色；印跡2為紅色）。 CV為0.27。 （b）來自兩個(gè)ICW板的重復(fù)孔的信號(hào)強(qiáng)度，以兩個(gè)板中每個(gè)板的平均值的比例繪制（板1為藍(lán)色；板2為紅色）。 CV范圍為0.08至0.16。

轉(zhuǎn)載自： PLoS One 5(4):e9965

ICW檢測(cè)結(jié)果中的信號(hào)增減與WB相似，IC50值也相似，但是標(biāo)準(zhǔn)差更小。在評(píng)估EGF受體抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，ICW檢測(cè)得到的IC50數(shù)值與發(fā)表文獻(xiàn)一致。384孔的ICW功能測(cè)定，用于監(jiān)測(cè)多巴胺D2和D2 G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的藥理作用。 GPCR激動(dòng)劑誘導(dǎo)ERK磷酸化，pERK作為細(xì)胞內(nèi)生化標(biāo)記物，用于評(píng)估多巴胺D2和D3受體激動(dòng)劑和拮抗劑。 這種非放射性測(cè)定的結(jié)果與其他功能測(cè)定相當(dāng)。 由于ERK是一種內(nèi)源性報(bào)告蛋白，因此無需進(jìn)行細(xì)胞修飾即可導(dǎo)入嵌合G蛋白或報(bào)告基因。  另一項(xiàng)GPCR激活研究直接將ICW檢測(cè)技術(shù)與公認(rèn)的cAMP結(jié)合和積累分析技術(shù)進(jìn)行了比較。 CREB磷酸化作為內(nèi)源性A 2A受體激活的標(biāo)志，其結(jié)果與放射性配體結(jié)合研究和cAMP免疫分析的結(jié)果密切相關(guān)。

ICW檢測(cè)的應(yīng)用

圖4. 用Wnt3a刺激細(xì)胞后，β-連環(huán)蛋白積聚的動(dòng)力學(xué)。 （a）用ICW測(cè)定法評(píng)估細(xì)胞β-連環(huán)蛋白的時(shí)間和劑量依賴性積累。 將L細(xì)胞與Wnt3a孵育，然后對(duì)β-catenin（合并圖像中的黃色）和DNA含量（紅色）染色。 （b）定量β-連環(huán)蛋白的積累。 在Wnt3a刺激的30分鐘內(nèi)，該水平被上調(diào)，在6至8小時(shí)之間顯示出增加的強(qiáng)度，并在10小時(shí)后開始達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)。 圖顯示了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式四份。

轉(zhuǎn)載自：PLoS One 3(10):e3498

ICW檢測(cè)提供了一種整體測(cè)量的“快照”式結(jié)果，在細(xì)胞固定的那一刻，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)狀態(tài)的檢測(cè)。對(duì)于貼壁細(xì)胞研究，ICW分析是流式細(xì)胞術(shù)的一種便捷替代方法，對(duì)于不需要高含量篩選（high  content  screening ：HCS）的研究，提供了一種低成本的替代方案。ICW檢測(cè)適用于監(jiān)視蛋白質(zhì)水平和磷酸化狀態(tài)，但不能微觀分析單個(gè)細(xì)胞的特征，例如蛋白質(zhì)易位或細(xì)胞形狀。 ICW分析已用于分析：1. 蛋白質(zhì)的磷酸化和信號(hào)傳導(dǎo)，2. 藥物對(duì)信號(hào)通路的脫靶作用，3. 信號(hào)事件的時(shí)機(jī)和動(dòng)力學(xué)（ 圖4），4. 病毒載量的定量分析，5. 遺傳毒性測(cè)定和細(xì)胞增殖測(cè)定，6. 幽門螺桿菌誘導(dǎo)的上皮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)原位分析，7. 糖蛋白分析，8. 文庫篩選和9.單克隆抗體克隆的篩選。

使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)進(jìn)行ICW實(shí)驗(yàn)

材料和方法

培養(yǎng)細(xì)胞

連續(xù)稀釋HeLa細(xì)胞，并以每孔0.2 mL的體積接種到96孔無菌組織培養(yǎng)板中，并生長至約80％匯合。 固定所有孔，并在室溫下使用100％甲醇滲透15分鐘。

In-cell Western（ICW）實(shí)驗(yàn)

固定和透化后，將細(xì)胞在PBS中沖洗，在室溫下用PBS中的1％魚明膠封閉1小時(shí)，然后在4°C下過夜孵育α-微管蛋白和β-肌動(dòng)蛋白一抗。 用PBS洗滌樣品3次，再與AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶聯(lián)的二抗孵育60分鐘。

二抗體與RedDot?1核染色一起孵育，以使總細(xì)胞數(shù)歸一化。板塊在成像前，用PBS洗滌樣品3次。

成像

洗滌后，使用板焦點(diǎn)設(shè)置選項(xiàng)，在Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)上對(duì)微孔板進(jìn)行成像。

結(jié)果與結(jié)論

在本實(shí)例中，我們展示了使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)，原位定量細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的能力。 HeLa細(xì)胞在96孔板中生長，先用α-微管蛋白和β-肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)，然后用分別與AzureSpectra 550和AzureSpectra 800偶聯(lián)的同種型合適的二抗進(jìn)行探測(cè)。 將所有孔與RedDot?1核染色液一起溫育以標(biāo)準(zhǔn)化總細(xì)胞數(shù)。 圖像使用Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)采集，顯示在圖6中。所示的代表性圖像證明了Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)的高靈敏度和特異性的信號(hào)采集。

在96孔板上進(jìn)行細(xì)胞ICW分析可準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的原位表達(dá)； 并提供了一種高通量方法，可評(píng)估多種刺激，多個(gè)終點(diǎn)，目的蛋白的表達(dá)水平，并能在單個(gè)孔板上重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 通過使用NIR抗體和Azure Biosystems Sapphire?雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)，還可以進(jìn)行多重分析，從而進(jìn)一步提高了通量。

圖5.  將連續(xù)稀釋的HeLa細(xì)胞播種到96孔板中，培養(yǎng)，固定和透化。A）列1-3使用AzureSpectra 550（綠色）染料檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白。B）第3-6列用AzureSpectra 800（藍(lán)色）染料檢測(cè)α-微管蛋白。C）整個(gè)板塊用RedDot1核染色作為歸一化對(duì)照（紅色）。D）各個(gè)通道同時(shí)掃描，然后用Sapphire Capture軟件合并成一個(gè)單一的復(fù)合圖像。

Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)是新一代的激光掃描成像系統(tǒng)，提供無與倫比的靈敏度、超高的分辨率、更寬的動(dòng)態(tài)范圍、提供更高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

● 唯一使用掃描式和CCD檢測(cè)雙模式的分子成像系統(tǒng)

● 唯一使用PMT，APDs和CCD三種檢測(cè)器進(jìn)行信號(hào)采集的系統(tǒng)

● 分辨率可達(dá)10μm，分辨更細(xì)節(jié)

● 動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)6logs，定量更準(zhǔn)確

● 軟件界面友好，易于使用