數(shù)字PCR是將PCR反應(yīng)分成許多單元，每個(gè)單元中都包含離散數(shù)量的靶基因拷貝（0，1，2，3 ，……）。數(shù)字PCR這項(xiàng)強(qiáng)大的技術(shù)，使得核酸定量，基因型檢測(cè)等應(yīng)用的檢測(cè)限更低，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。本文從分區(qū)的優(yōu)點(diǎn)和泊松統(tǒng)計(jì)開始，包括誤差的來源方面，探討一下數(shù)字PCR的數(shù)學(xué)原理。我們討論比較五種商品化的數(shù)字PCR儀器，主要分為芯片型（cdPCR）和液滴型（ddPCR）的兩種，并對(duì)市面上主流的數(shù)字PCR參數(shù)進(jìn)行了比較。

1.     數(shù)字分析檢測(cè)和模擬分析檢測(cè)

圖1. 模擬分析檢測(cè)（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）和數(shù)字分析檢測(cè)（數(shù)字PCR）的比較

模擬分析檢測(cè)是在反應(yīng)體系中檢測(cè)與總體核酸樣品濃度C成正比的讀出信號(hào)A。通常使用熒光方法進(jìn)行檢測(cè)，例如使用標(biāo)記的探針，檢測(cè)熒光信號(hào)，從而定量靶基因的核酸拷貝數(shù)。數(shù)字分析檢測(cè)是首先將樣品分到多個(gè)單元中，每個(gè)單元的都包含離散數(shù)量的靶基因拷貝（0，1，2，3 ，……），每個(gè)單元都被獨(dú)立檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為0（陰性）或1（陽性），標(biāo)示獨(dú)立單元中是否存在靶基因拷貝。利用泊松分布統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)陰性單元的比例，就能夠計(jì)算出原始樣品中靶基因的拷貝數(shù)。

數(shù)字PCR的概念來源于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，計(jì)算機(jī)中的數(shù)字回路提供二進(jìn)制輸出。數(shù)字信號(hào)在計(jì)算和通信領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，信息被編碼為一系列0和1。數(shù)字信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)是降低了檢測(cè)元素的負(fù)擔(dān)，每個(gè)元素只需要區(qū)分兩種信號(hào)：陰性和陽性。在數(shù)字PCR中，儀器只需要分辨陰陽性的區(qū)別就可以了，然后通過泊松分布的統(tǒng)計(jì)方式，可以得知陰性單元的比例與樣品中的靶基因拷貝數(shù)相關(guān)。

2.     分區(qū)的優(yōu)點(diǎn)

圖2. 數(shù)字PCR進(jìn)行分區(qū)的好處：A. 增加靶基因的有效濃度，B. 富集效果，降低背景干擾。

隨著分區(qū)后，單元數(shù)量的增加和單元體積的減少，能夠體現(xiàn)出三個(gè)明顯的好處。

第一個(gè)好處是：顯著降低檢測(cè)限（LOD：Limit of detection）。因?yàn)?strong>分區(qū)單元的體積越小，每個(gè)單元中靶基因拷貝的濃度越高。這種特性使得數(shù)字PCR能夠進(jìn)行微量的核酸檢測(cè)，或者檢測(cè)分泌到細(xì)胞外環(huán)境的核酸。

第二個(gè)好處是：分區(qū)后，每個(gè)單元的富集作用能夠有效改善復(fù)雜混合物檢測(cè)結(jié)果。具體的說數(shù)字PCR方法提升了感興趣靶點(diǎn)的信號(hào)，拉開了與背景信號(hào)的比值。以圖2B為例，在數(shù)字PCR反應(yīng)體系中，一個(gè)分區(qū)單元中實(shí)現(xiàn)了8倍純化，另一個(gè)分區(qū)單元中實(shí)現(xiàn)了完全純化。數(shù)字PCR的富積效應(yīng)有效實(shí)現(xiàn)了低豐度核酸對(duì)野生型背景的擴(kuò)增效率，對(duì)于癌癥診斷等應(yīng)用非常有用。分區(qū)數(shù)量的越多，數(shù)字PCR的富集作用越強(qiáng)。

第三個(gè)好處是：數(shù)字PCR在計(jì)算靶基因拷貝數(shù)時(shí)，相比實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠提供更加出色檢測(cè)精度和線性。因?yàn)閿?shù)字PCR檢測(cè)的是PCR體系中的單個(gè)靶基因分子，而不是靶基因在反應(yīng)體系中的整體濃度。數(shù)字PCR檢測(cè)精度隨著分區(qū)數(shù)量提高而提高；分區(qū)數(shù)量的增加也會(huì)擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍，提升被檢測(cè)樣品的濃度范圍。

3.     分區(qū)的方法：物理隔室和微滴

目前主流的數(shù)字PCR系統(tǒng)主要使用兩種方式實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)體系的分區(qū)：1）使用物理的腔室或小孔陣列，2) 使用微滴乳液方式，在連續(xù)的油相中分隔水相（PCR反應(yīng)體系）。通過這兩種方式，實(shí)現(xiàn)不同的分區(qū)單元的體積。

腔室陣列也稱為芯片式數(shù)字PCR，通過使用光刻工藝和微細(xì)加工工藝實(shí)現(xiàn)腔室小型化。例如，光刻和硅蝕刻工藝已被用于制造50,000個(gè)用于數(shù)字酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的孔，每個(gè)孔的體積為50fL。用于執(zhí)行數(shù)字酶分析的類似平臺(tái)，孔設(shè)計(jì)為可容納1.4 fL也可以通過在1μm的硅結(jié)構(gòu)上微成型柔性彈性體（PDMS）來制造。腔室陣列也可以使用微成型或壓印光刻技術(shù)在塑料中制備，以及使用軟光刻的變體在其他材料中制成。生產(chǎn)過程的再溶解決定了體積的可變性。使用光刻技術(shù)，公差可以小至數(shù)百納米，而使用納米級(jí)壓印光刻技術(shù)，公差可以小于25 nm。分區(qū)單元的體積可變性會(huì)導(dǎo)致數(shù)字計(jì)數(shù)分析的不確定性，這個(gè)我們下一節(jié)再說。

圖3. 微滴式數(shù)字PCR微流控示意圖，a）液流與油流十字交叉結(jié)構(gòu)，b）液流與油流T型接頭結(jié)構(gòu)。

第二種分配方法是利用油中的液滴乳液（微滴式數(shù)字PCR）。通過使用微流控T型接頭制備單分散液滴，其中水流與油流結(jié)合，或者通過液流聚焦交叉幾何結(jié)構(gòu)將水流與兩條正交油流結(jié)合。更先進(jìn)的方式是通過約束梯度來生成微滴，通過將液流通過一個(gè)固定角度的斜坡，不依賴流體流動(dòng)的生成液滴，液滴的大小更加穩(wěn)定。微滴式數(shù)字PCR中的油相是非反應(yīng)性的，對(duì)水相成分溶解度很低，防止PCR反應(yīng)物在微滴單元之間擴(kuò)散；通常選擇碳氟化合物油。穩(wěn)定的液滴生成需要添加表面活性劑來穩(wěn)定水油界面并防止液滴聚結(jié)。必須對(duì)表面活性劑進(jìn)行優(yōu)化，使其不干擾檢測(cè)，并防止小生物分子擴(kuò)散到油中。

圖3. 基于約束梯度生成微滴的結(jié)構(gòu)草圖，水相（藍(lán)色）通過路口通道進(jìn)入裝滿油相（橙色）的儲(chǔ)液器中，儲(chǔ)液器的頂部傾斜了一個(gè)角度α。水相進(jìn)入油相后，通過固定角度的斜坡，不需要流動(dòng)的油相，形成大小均一的微滴。

通常來說，芯片式數(shù)字PCR的物理腔室的體積差異的分散度<3%，微滴式數(shù)字PCR的微滴體積差異分散度<5%，但是基于約束梯度生成微滴的方式生成的微滴，微滴的體積差異小于芯片式數(shù)字PCR，體積差異分散度可低至0.1%，是目前最先進(jìn)的微滴生成方式。芯片式數(shù)字PCR在物理腔室的內(nèi)壁上需要涂抹封閉劑（例如，牛血清白蛋白），防止生物分子被腔室壁吸附和防止PCR反應(yīng)酶失活。微滴式數(shù)字PCR需要使用兩性親和表面活性劑（例如，聚乙二醇）來穩(wěn)定水油界面。

4.     分區(qū)的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

在數(shù)字PCR系統(tǒng)中，分區(qū)統(tǒng)計(jì)能夠確定樣品中靶基因拷貝濃度和置信區(qū)間。分區(qū)操作類似我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中分裝樣品，但是實(shí)驗(yàn)室中分裝樣品時(shí)，由于每個(gè)分裝數(shù)量較少，每個(gè)單元中包含有大量樣品，體現(xiàn)不出樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在數(shù)字PCR系統(tǒng)中，需要將PCR體系分區(qū)為數(shù)以萬計(jì)的單元；這時(shí)就無法忽視統(tǒng)計(jì)學(xué)差異了。在數(shù)字PCR系統(tǒng)中，反應(yīng)體系中總的靶基因拷貝數(shù)（m），m的數(shù)量級(jí)總是小于分區(qū)單元的總數(shù)量（n）的數(shù)量級(jí)，單個(gè)分區(qū)單元中平均包含（λ）個(gè)靶基因拷貝，通過λ的數(shù)值可計(jì)算樣品中靶基因拷貝的濃度。

公式1. λ是每個(gè)分區(qū)單元中的平均靶基因拷貝數(shù)，m是反應(yīng)體系中總的靶基因拷貝數(shù)，n是分區(qū)單元的總數(shù)，C是靶基因拷貝在PCR反應(yīng)體系的濃度，V_d是分區(qū)單元的體積。

每個(gè)分區(qū)的單元中實(shí)際包含的靶基因拷貝數(shù)量是離散的（例如，0，1，2，3，……），那么分區(qū)中包含k個(gè)靶基因拷貝數(shù)的概率服從泊松分布（Poisson Distribution）。

公式2. 泊松分布的公式

  泊松分布的均值和反差均等于λ，μ = σ² = λ，陰性分區(qū)的單元的概率為p(0)= e^-λ，因此，靶基因拷貝數(shù)（m）和樣品濃度C可以很容易地從陰性分區(qū)單元的百分比（E）推導(dǎo)出來。

公式3. 樣品濃度C和靶基因拷貝數(shù)m推導(dǎo)過程

圖4. 泊松分布統(tǒng)計(jì)信息。 （A）對(duì)于各種樣本濃度λ，一個(gè)分區(qū)單元包含k個(gè)拷貝的概率。 （B）對(duì)于各種樣品濃度λ，每個(gè)分區(qū)單元分別為0，1，2和3個(gè)拷貝的概率。 A和B均使用泊松分布進(jìn)行計(jì)算。

5.     數(shù)字PCR的誤差來源

在常規(guī)的模擬分析檢測(cè)（realtime-PCR）中，測(cè)量不確定度通常受檢測(cè)儀器的分辨率限制，例如，熒光檢測(cè)器能夠分辨發(fā)射熒光的微小差異。 在像數(shù)字PCR這樣的數(shù)字化檢測(cè)中，檢測(cè)系統(tǒng)僅需識(shí)別一個(gè)分區(qū)單元是0還是> 1（陰性還是陽性），這使得數(shù)字PCR對(duì)檢測(cè)器或檢測(cè)過程化學(xué)性質(zhì)的依賴性降低，對(duì)于PCR反應(yīng)的抑制劑不敏感。數(shù)字PCR有兩個(gè)誤差來源：采樣誤差和分配誤差。采樣誤差設(shè)定了低濃度下檢測(cè)限的下限，與儀器無關(guān)，而分配誤差在高濃度下占主導(dǎo)地位，取決于儀器的采樣與分區(qū)性能。

采樣誤差是任何生物檢測(cè)都會(huì)出現(xiàn)的子樣本誤差，由于采樣并不能分析所有的樣品體積，只能分析其中的一個(gè)子樣品，從而倒置重復(fù)測(cè)試之間的統(tǒng)計(jì)差異。例如，像血清這樣的診斷樣品可能有5ml，但是我們只能取其中20μl樣品進(jìn)行檢測(cè)。這個(gè)采樣的過程引入一個(gè)不可避免的誤差，特別是當(dāng)原始樣品中需要被檢測(cè)的靶基因拷貝數(shù)很少時(shí)。當(dāng)對(duì)于較大樣品的一部分進(jìn)行采樣時(shí)，每個(gè)樣本中靶基因拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 ,m是分區(qū)單元中預(yù)期的靶基因拷貝數(shù)，基于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量的不確定度計(jì)算如下：對(duì)于95%置信區(qū)間(CI)，Zc為1.96。

分配誤差，這個(gè)是只有數(shù)字PCR系統(tǒng)才有的誤差，因?yàn)橥粋€(gè)實(shí)驗(yàn)中靶基因的拷貝分布可能每次都不同。陰性分區(qū)單元的百分比（E）的標(biāo)準(zhǔn)誤差為 ，基于標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量的不確定度計(jì)算如下：

分配誤差在靶基因拷貝濃度特別高（λ數(shù)值大）的時(shí)候和靶基因拷貝濃度特別低（λ數(shù)值?。┑臅r(shí)候非常顯著，靶基因濃度高的時(shí)候，幾乎沒有陰性分區(qū)單元（E趨近于0）；靶基因濃度特別低的時(shí)候，則幾乎全部都是陰性分區(qū)單元(E趨近于1)。在低濃度下，分配誤差包含采樣誤差，因?yàn)閮蓚€(gè)誤差都基于二項(xiàng)式分布和泊松分布的相同概念。在實(shí)踐中，我們可以通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，降低實(shí)驗(yàn)帶來的不確定度。

假設(shè)A系統(tǒng)產(chǎn)生2萬個(gè)微滴和B系統(tǒng)產(chǎn)生100萬個(gè)微滴，則數(shù)字PCR檢測(cè)中的采樣誤差和分區(qū)誤差在不同濃度中的數(shù)值曲線。

圖5比較了在2萬個(gè)微滴和100萬個(gè)微滴的情況下，采樣誤差和分配誤差帶來的影響。在λ數(shù)值很大的情況下，分配誤差限制了可以檢測(cè)的最大濃度；在λ數(shù)值很小的情況下，兩種誤差都會(huì)增加?？梢钥吹剑?strong>微滴數(shù)量越多，在相同λ數(shù)值下，誤差越小，說明了分區(qū)數(shù)量越多，儀器誤差越小的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。

泊松分布的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)是假設(shè)所有的分區(qū)單元體積和PCR反應(yīng)條件都保持完全一致，沒有考慮分配體積變化產(chǎn)生的影響，微滴體積的不一致會(huì)扭曲靶基因拷貝的分布。因此實(shí)際誤差會(huì)包含微滴體積的不確定度影響。將體積不確定度定義為，結(jié)合分配誤差，可以得到

實(shí)際上微滴體積的不一致性還是挺重要的，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性產(chǎn)生的誤差條主要受到體積不確定性的影響，基于約束梯度生成微滴原理的數(shù)字PCR儀器，能夠獲得最好的重復(fù)性。

6.     數(shù)字PCR系統(tǒng)的介紹

圖6. 數(shù)字PCR中的擴(kuò)增和檢測(cè)化學(xué)（與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相同）。 （A）水解探針（例如Taqman）。 （B）DNA結(jié)合探針（例如Evagreen）

數(shù)字PCR的檢測(cè)原理與熒光定量PCR相同，只是在定量方式上有所不同。數(shù)字PCR反應(yīng)體系中包含目標(biāo)DNA，PCR試劑和熒光標(biāo)記物，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，在循環(huán)結(jié)束后，終點(diǎn)檢測(cè)每個(gè)分區(qū)單元中的熒光信號(hào)。熒光標(biāo)記物為水解探針（探針法如，Taqman）或嵌入DNA的結(jié)合燃料（染料法如，Evagreen）。使用終點(diǎn)法檢測(cè)，PCR循環(huán)數(shù)通常>30，即使微滴中只含有1個(gè)靶基因拷貝也能被檢測(cè)到，與擴(kuò)增效率無關(guān)。通過檢測(cè)熒光信號(hào)為陰性的微滴比例，可以通過泊松分布求出靶基因拷貝的絕對(duì)濃度，不需要依賴參考曲線。對(duì)于高濃度的樣品，需要事先進(jìn)行稀釋，將λ數(shù)值置入適合置信區(qū)間的泊松分布定量范圍（0.0001-6），這樣才能獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

7.     數(shù)字PCR之間的比較

圖7. 商業(yè)dPCR系統(tǒng)。 （A，B）芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)。 （A）Fluidigm BioMark系統(tǒng)，包括（A左）芯片，（A右上）BioMark HD循環(huán)儀，（A右下）EP1閱讀器和（未示出）IFC控制器。（A中）：來自基因表達(dá)研究的熒光圖像。 （B）Thermo Fisher Quantstudio 3D，包括（B左）帶有20,000個(gè)腔室的開放式芯片，（B右）檢測(cè)系統(tǒng)和（未顯示）熱循環(huán)儀。 （C-E）微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)。 （C）Bio-Rad QX100 / 200，包括（C左）液滴生成芯片，（C中）液滴檢測(cè)系統(tǒng)以及相應(yīng)的儀器。（C右）：拷貝數(shù)變異研究中的兩通道散點(diǎn)圖。（D）RainDrop系統(tǒng)，包括源芯片和傳感芯片以及它們各自的儀器。（D左下）：突變檢測(cè)中擴(kuò)增后的兩個(gè)彩色熒光液滴。D右：來自突變檢測(cè)的典型兩通道散點(diǎn)圖。（E）Stilla Naica系統(tǒng)，包括（E左）Sapphire芯片和（E中）Naica Geode液滴發(fā)生器/熱循環(huán)儀，以及（E右上）Naica Prism3檢測(cè)系統(tǒng)。（E右下）：擴(kuò)增后的三色熒光滴。

目前的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)主要分為兩大類：1.芯片式數(shù)字PCR（cdPCR），2.微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）。芯片式數(shù)字PCR代表型號(hào)包括：Fluidigm公式的BioMark系統(tǒng)，Thermo Fisher公式的Quantstudio 3D系統(tǒng)。微滴式數(shù)字PCR代表型號(hào)包括：RainDance公司的RainDrop系統(tǒng)（2017年被收購，目前已經(jīng)推出市場(chǎng)），Bio-red公司的QX100 / 200系統(tǒng)，以及Stilla公司的Naica系統(tǒng)。相關(guān)參數(shù)的對(duì)比見下表：

表1. 主流商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)參數(shù)比較

很顯然，微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)可以更加經(jīng)濟(jì)高效的在單一樣品產(chǎn)生更多的分區(qū)單元，增加的分區(qū)數(shù)量的好處如將所述：第一，顯著降低檢測(cè)限，樣品濃度非常低的時(shí)候依然能進(jìn)行有效檢測(cè)；第二，產(chǎn)生富集效應(yīng)，在相似的核酸背景中檢測(cè)稀有靶標(biāo)能力，這有助于檢測(cè)野生型群體中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和其他稀有等位基因，例如循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）；第三，增加動(dòng)態(tài)范圍，因此無需稀釋即可容納更大范圍的樣品。Stilla公司的Naica系統(tǒng)是目前主流商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)中有效微滴數(shù)量最多的系統(tǒng)，檢測(cè)范圍更寬，分辨率更高，數(shù)據(jù)更為精準(zhǔn)。

熒光通道的數(shù)量決定數(shù)字PCR系統(tǒng)在同一個(gè)樣品中檢測(cè)復(fù)數(shù)靶標(biāo)的能力，Stilla公司的Naica系統(tǒng)是唯一提供3色熒光通道的數(shù)字PCR系統(tǒng)。目前熒光定量檢測(cè)試劑盒多為3色試劑盒（例如新型冠狀病毒ORF1ab、N、E三個(gè)基因靶標(biāo)試劑盒），數(shù)字PCR的檢測(cè)也會(huì)朝著這個(gè)方向進(jìn)行發(fā)展。

可以看出Stilla公司的Naica系統(tǒng)在多個(gè)系統(tǒng)的比較中，是微滴生成數(shù)量最多的系統(tǒng)，也是唯一一個(gè)具有3重?zé)晒馔ǖ赖臄?shù)字PCR，能夠在同一個(gè)樣品中同時(shí)進(jìn)行3個(gè)基因靶標(biāo)的檢測(cè)。除此以外，Naica系統(tǒng)操作簡單，反應(yīng)快速，2.5小時(shí)內(nèi)即可獲得檢測(cè)結(jié)果，也是市面上唯一一款具備微滴回溯和質(zhì)控功能的數(shù)字PCR系統(tǒng)，完全區(qū)別于同類產(chǎn)品。Naica數(shù)字PCR系統(tǒng)支持廣泛的基因檢測(cè)和分子生物學(xué)分析，包括用于癌癥診斷的液體活檢研究、病毒載量檢測(cè)、產(chǎn)前篩查和轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)等，是精準(zhǔn)治療中用藥組合和療效監(jiān)測(cè)的首選技術(shù)。