睡美人轉座子系統(tǒng)簡介——無需病毒包裝高效基因整合

Sleeping Beauty轉座子系統(tǒng)由Sleeping Beauty（SB）轉座酶和轉座子組成，SB轉座子系統(tǒng)可將特定的DNA序列插入脊椎動物的基因組中。 DNA轉座子以剪切/粘貼的方式，將一條DNA片段轉移到另一條DNA片段上。轉座（Transposition）是一個精確的過程，在供體DNA分子中剪切特定的DNA片段，然后移至相同或不同DNA分子或基因組中的另一個位點。

Sleeping Beauty轉座子系統(tǒng)原理示意圖

睡美人轉座酶因其在魚類中發(fā)現(xiàn)的有缺陷的轉座酶而被命名為睡美人。已經(jīng)在許多不同魚類的基因組中以各種非功能性形式發(fā)現(xiàn)了該轉座酶，據(jù)信這種轉座酶已經(jīng)有數(shù)百萬年的歷史了。研究者通過融合和修飾各種已滅絕的轉座酶來合成第一個功能性SB系統(tǒng)。此后，通過增加大量已滅絕的轉座子序列之間的共有序列，然后測試各種變化的組合，進行了改進。

SB100X質(zhì)粒圖譜

1997年開發(fā)的Sleeping Beauty轉座子系統(tǒng)（SB10）的基本功能版本不斷更改，以提高轉座子系統(tǒng)在細胞中的基因插入效率。 2009年，Zsuzsanna Izsvak的實驗室篩選了許多SB轉座酶變體，以檢測哺乳動物細胞中的活躍成都。他們的努力產(chǎn)生了一種新的改良型SB轉座酶SB100X，其效率比第一代轉座酶高100倍（通過在HeLa細胞中進行的抗生素抗性基因的轉座試驗確定）。在他們的Nature Genetics論文中，實驗室表明使用SB100x進行基因整合的效率與病毒載體的穩(wěn)定轉導效率相當。

SB蛋白的結構域組成和SB100X轉座酶催化結構域（PDB 5CR4）35的晶體結構，其hsSB取代標記為（紅色）。 結構上被掩埋的半胱氨酸（灰色）被突變?yōu)閷φ铡?/p>

2019年Querques等研究者將突變I212S和C176S引入SB100X轉座酶。 改善了SB轉座酶的蛋白穩(wěn)定性，溶解度和聚集特性。通過引入這兩個突變，創(chuàng)建了一種新型的轉座酶變體，稱為高溶解性SB（hsSB），顯著提高溶解性和穩(wěn)定性。hsSB能夠被純化，具有生物活性的重組蛋白，也可以將蛋白電穿孔到細胞中，進行凍融循環(huán)，而不會影響轉座酶的活性和抗熱激性。已證明，hsSB蛋白的電轉能夠介導各種人類和哺乳動物細胞類型的基因整合（包括難以轉染的細胞模型，例如胚胎干細胞，HSPC，誘導多能干細胞（iPSC），T細胞和原代細胞），使用hsSB修飾以表達抗CD19 CAR，在已批準的基于病毒載體的市售產(chǎn)品中，該CD19 CAR在異種移植小鼠中顯示出生物學活性和抗腫瘤能力。

利用SB轉座子技術一步產(chǎn)生轉基因牛

與經(jīng)典的直接原核注射或慢病毒介導的轉基因方法相比，SB介導的轉基因不易發(fā)生基因鑲嵌和基因沉默。轉座子載體與特定的啟動子元件結合，可以在組織中控制基因表達的程度，特異性的控制轉基因表達。目前，研究者已經(jīng)建立了不同種屬中使用SB實現(xiàn)高效轉基因的實驗流程，包括斑馬魚，小鼠和大鼠中的持續(xù)轉基因表達，兔子，豬和牛。值得注意的是，即使在牛這種的大型動物模型中，利用SB產(chǎn)生多轉基因動物的方法也獲得了成功。已建立的方案能夠在相對短的時間范圍內(nèi)產(chǎn)生復雜的轉基因基因型。

SB轉座子系統(tǒng)，作為一種非病毒載體轉基因技術，它能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生足量轉基因細胞用于臨床治療，同時具有相對較低的成本，質(zhì)粒在儲存期間的穩(wěn)定性大于病毒載體，同時也非常安全。

插圖顯示了基于SB轉座子系統(tǒng)的CAR-T細胞的血液惡性腫瘤的免疫治療方案

SB轉座子系統(tǒng)作為基因呈遞系統(tǒng)的臨床應用，作為二線治療方案，在CD19+急性白血病和淋巴瘤晚期患者中得到了最廣泛的檢驗。SB系統(tǒng)用于用第二代CAR靶向CD19的基因工程T細胞，從而將T細胞重新導向CD19表達的腫瘤。大多數(shù)臨床試驗都使用慢病毒轉染修飾T細胞，使其表達第二代CARs，包括單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)與CD28或4-1BB(CD137)共刺激域融合片段，與嵌合體CD3-ξ提供'信號1和2' (即由CD3-ξ和CD28發(fā)起的信號)。給予患者來源的第二代CD19+CAR-T細胞在化療難治性B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)患者中表現(xiàn)出活性，反應率高達90%，在難治性B細胞淋巴瘤患者中總反應率高達70%。

MD安德森癌癥中心(MDACC)的一個小組利用SB非病毒系統(tǒng)將CAR導入患者和供體衍生的T細胞中。80名患者已經(jīng)被招募到這些臨床試驗中，表明轉座子工程CAR-T產(chǎn)品的生產(chǎn)具有可行性和穩(wěn)健性。通過電轉方法制備的CAR-T細胞效率與慢病毒載體相似，但是成本遠低于慢病毒方法。

SB轉座子的質(zhì)粒體系通常有以上三種方式，SB轉座酶可以是1. 單獨質(zhì)粒骨架，2.目的基因在同一個質(zhì)粒骨架，3. 或體外合成的mRNA。由于SB轉座酶需要的拷貝數(shù)通常高于目的基因，因此1和3形式的反應體系較為多見。一個目的基因的拷貝大約需要4個SB轉座酶蛋白分子，這樣的比例可以產(chǎn)生最高的基因整合效率。

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