Nature Protocol：i-GONAD技術(shù)詳解

CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀原位遞送RNPs至受精卵制備CRISPR基因編輯工程小鼠

摘要：

創(chuàng)建基因工程小鼠的傳統(tǒng)方法包括三個主要步驟：1. 從一組雌性動物中收獲胚胎，2. 將試劑微注射到離體胚胎中，3. 然后通過外科手術(shù)將其轉(zhuǎn)移到另一組雌性動物中，盡管繁瑣，但這些方法已經(jīng)使用了三十多年。研究者最近開發(fā)了一種名為GONAD的方法（genome editing via oviductal nucleic acids delivery），該方法繞開了這些步驟。GONAD技術(shù)將將CRISPR成分（Cas9 mRNA和guide RNA（gRNA））注入孕后1.5d孕鼠的輸卵管，通過CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀，在體內(nèi)電穿孔將這些核酸組分原位遞送到受精卵中，使用GONAD證明了靶基因可以在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段被破壞和分析。

現(xiàn)在，研究者開發(fā)了改良版GONAD（i-GONAD）。 通過CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀導(dǎo)入CRISPR RNPs（RNPs：Cas9蛋白/Cpf1蛋白 + gRNA）進入第0.7天孕鼠體內(nèi)，使其適合常規(guī)基因?qū)?，提供單?span lang="EN-US">DNA（ssDNA）修復(fù)模板后，i-GONAD還可以生成包含多達1kb插入片段的敲入模型，基因編輯效率更高。i-GONAD還具有其他優(yōu)勢：不需要切除輸卵管或子宮，使用i-GONAD的雌鼠不會被處死，還可以用于其他實驗，掌握小動物手術(shù)的研究人員在沒有精密顯微注射設(shè)備的實驗室中就能輕松進行，高效同時也節(jié)省成本。

這個protocol提供了建立GONAD方法的分步方案，該方案需要約6周的時間來生成G0代基因工程小鼠。

整個i-GONAD技術(shù)的流程中不需要精密的顯微注射步驟，需要的儀器僅為體式顯微鏡（Olympus, model no. SZ11)）和CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀，以及一些常用的手術(shù)器械。

關(guān)鍵的電轉(zhuǎn)步驟如圖所示

上圖顯示體內(nèi)電轉(zhuǎn)的示意圖（步驟22–26）。a. 用一塊濕的Kimwipe毛巾覆蓋輸卵管。b. 將電極浸入滅菌PBS中。c.將電極放置在被Kimwipe覆蓋的輸卵管上，以抓住組織，使用CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)（ 左）和輸卵管的電轉(zhuǎn)（右）。d. 最好用蘸有70％（vol/vol）乙醇的棉布擦拭電極的內(nèi)表面，以清潔后再用于輸卵管。

在不同的實驗條件下，對8至10周齡的C57BL / 6J雌性小鼠進行實驗，使用CUY21Edit II電轉(zhuǎn)儀進行100 mA電轉(zhuǎn)的i-GONAD，實驗觀察到100 mA電流在C57BL / 6小鼠品系中產(chǎn)生最一致和最佳的結(jié)果，在這種電穿孔條件下，在Tyr locus中獲得了96％的indel突變效率。 電流200mA以上的時候基因編輯效率高達100%，但是小鼠胚胎數(shù)量會變少，因此作者推薦大部分小鼠品系選擇電流的時候選擇50-200mA區(qū)間范圍（50mA，100mA，150mA，200mA）。

Nature Protocol中電轉(zhuǎn)條件為CUY21Edit II: square (mA), (+/?), Pd V (voltage of the pulses): 60 V or 80 V, Pd A (current of the pulses): 100–150 mA, Pd on: 5.00 ms, Pd off: 50 ms, Pd N (pulse cycle): 3, decay: 10%, decaytype: Log

GONAD后植入前小鼠胚胎中的熒光。（a）-（c）從MCH（ICR）雌性收集的兩細(xì)胞胚胎，在注射溶液后進行i-GONAD實驗流程，含有四甲基羅丹明標(biāo)記的葡聚糖3kDa（紅色），EGFP mRNA（綠色），注意觀察到的胚胎既有紅色也有綠色，（d）至（f）為從MCH（ICR）雌性收集的兩細(xì)胞胚胎經(jīng)過類似處理的對照組實驗結(jié)果 ?？梢杂^察到CUY21Edit II電轉(zhuǎn)效率非常高。

CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀：

?通過該儀器實現(xiàn)了精確的矩形波和雙脈沖衰減脈沖波輸出

?可以用于體內(nèi)和體外實驗的真正的電基因轉(zhuǎn)移裝置

?業(yè)界首款恒流脈沖輸出

?恒定電流脈沖非常適合諸如GONAD之類的體內(nèi)電轉(zhuǎn)

?出色的觸摸屏操作性

?記錄所有輸出脈沖的執(zhí)行電壓和電流值

?輸出脈沖記錄可以導(dǎo)出到USB存儲器

在電轉(zhuǎn)實驗中，電穿孔造成細(xì)胞損壞程度主要取決于電流大小，電流值決定電穿孔的成敗。

示例）在鑷子型電極之間夾有樣品（卵形管）時即使電壓相同，根據(jù)電極之間的距離和電極的狀態(tài)（氧化等），流過的電流也不同。

CUY21 EDIT II能夠?qū)崟r檢測電阻，控制電壓，產(chǎn)生恒流的電流脈沖輸出。換句話說，將輸卵管夾在鑷子型電極之間的GONAD實驗中，即使各實驗之間的夾持力不同，電流依然保持恒定值。在多種具有許多參數(shù)變量的體內(nèi)電穿孔，可以保持電參數(shù)固定，帶給您更好的實驗重復(fù)性和更高的基因?qū)?span lang="EN-US">/編輯效率。

CUY21 EDIT II電轉(zhuǎn)儀滿足所有活體電轉(zhuǎn)，原代細(xì)胞（如原代神經(jīng)元），貼壁細(xì)胞，難轉(zhuǎn)染細(xì)胞等的高效基因轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)過程無需特殊溶液，為您節(jié)省成本，減少操作，提升效率。

文獻來源：

Nat Protoc. 2019 Aug;14(8):2452-2482. doi: 10.1038/s41596-019-0187-x.