自1979年首次發(fā)表以來(lái)，Western Blot（WB）實(shí)驗(yàn)一直是測(cè)定復(fù)雜生物樣品中蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，文章發(fā)表越來(lái)越注重標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。歸一化是WB實(shí)驗(yàn)中重要的內(nèi)部控制過(guò)程，通過(guò)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)運(yùn)算，降低泳道之間和樣品之間難以避免的上樣差異。通常WB實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參為不受實(shí)驗(yàn)影響的內(nèi)源性蛋白。將內(nèi)參蛋白作為上樣濃度的指標(biāo)。

大部分WB實(shí)驗(yàn)都使用管家蛋白（Housekeeping proteins）作為內(nèi)參蛋白，通常使用的管家蛋白為：肌動(dòng)蛋白（如：β-actin），微管蛋白（如：α-tubulin），3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。通常，這些管家蛋白在細(xì)胞和組織中高度表達(dá)，但是管家蛋白在實(shí)驗(yàn)中也經(jīng)常受到病理?xiàng)l件和實(shí)驗(yàn)條件的影響。例如，細(xì)胞匯合度（Cell Confluence），上樣蛋白總量和細(xì)胞/組織類(lèi)型都有可能影響看家蛋白的表達(dá)水平。例如，NIH3T3成纖維細(xì)胞中細(xì)胞匯合度從10%增加到100%的過(guò)程中（細(xì)胞瓶長(zhǎng)滿的過(guò)程），α-tubulin和GAPDH表達(dá)明顯增加。WB實(shí)驗(yàn)在較大的總蛋白量上樣量條件下，β-actin的一抗會(huì)無(wú)法檢測(cè)蛋白含量變化。不同的研究如果使用的看家蛋白不一致，很難進(jìn)行相互之間的比較，數(shù)據(jù)分析和解釋也會(huì)不準(zhǔn)確。如果研究人員希望使用看家蛋白作為歸一化方式，還需要驗(yàn)證這個(gè)看家蛋白不受實(shí)驗(yàn)條件的影響。因此一種不受實(shí)驗(yàn)條件影響的，統(tǒng)一的歸一化方法顯得非常有必要。

總蛋白歸一化（Total protein normalization）是目前最可靠的WB實(shí)驗(yàn)蛋白歸一化方法?？偟鞍讱w一化在靈敏度，可重復(fù)性方面均優(yōu)于看家蛋白實(shí)驗(yàn)方式，研究者需要熒光成像系統(tǒng)和熒光染料標(biāo)記的二抗，就可以進(jìn)行總蛋白歸一化精確定量上樣蛋白。一般來(lái)說(shuō)，總蛋白歸一化適合高表達(dá)量和低表達(dá)量的目的蛋白檢測(cè)，常見(jiàn)的看家蛋白僅僅適合高表達(dá)量的目的蛋白檢測(cè)。如果一定要使用看家蛋白進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在的期刊要求研究者：1）測(cè)定看家蛋白和目的蛋白的線性范圍，2）在不同的實(shí)驗(yàn)條件下證明看家蛋白不受到實(shí)驗(yàn)條件影響，3）補(bǔ)充信息驗(yàn)證一抗的特異性，或者建議至少使用兩種看家蛋白，一種表達(dá)量高，一種表達(dá)量低，作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化。由于實(shí)驗(yàn)課題通常包含多個(gè)目的蛋白的檢測(cè)，多次重復(fù)看家蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)增加相當(dāng)大的工作量，因此使用蛋白歸一化可以減少工作量，節(jié)約研究者寶貴的時(shí)間。

圖1. 證實(shí)了β-actin和β-tubulin在病理組織中表達(dá)改變。 SMA脊髓提取物中檢測(cè)肌動(dòng)蛋白和微管蛋白。 A.綠色（42 kDa）的β-actin條帶與總蛋白染色的凝膠（紅色）重疊。 B.以總蛋白染色的凝膠（紅色）覆蓋綠色（60 kDa）的β-tubulin條帶。 C.當(dāng)比較SMA小鼠（SMA）與野生型對(duì)照（WT）時(shí)，β-actin（黑色條）和β-tubulin（灰色條）的表達(dá)水平的百分比變化的定量結(jié)果。 總蛋白染色（白條）用作對(duì)照。

很多文章將總蛋白歸一化與常見(jiàn)的看家蛋白進(jìn)行比較，證明了在定量WB實(shí)驗(yàn)中，相同的上樣量條件下，常見(jiàn)的看家蛋白會(huì)在組織中差異表達(dá)。例如，在脊髓性肌萎縮癥小鼠模型中，與健康野生小鼠相比，疾病組β-actin和β-tubulin在脊髓組織中的表達(dá)量都會(huì)減少，β-actin表達(dá)降低了19.3±2%，β-tubulin表達(dá)降低了7.3±0.5%。如果使用了β-actin作為WB實(shí)驗(yàn)的看家蛋白作為內(nèi)參，WB的定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可能偏離了20%。看家蛋白作為上樣內(nèi)參（Loading control）的時(shí)候，線性范圍非常窄，極大的限制了研究者的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，難以滿足WB實(shí)驗(yàn)的定量需求。

圖3. 蛋白質(zhì)稀釋系列的定量顯示β-actin（黑色圓圈）和β-tubulin（空心三角形）的線性范圍。 β-tubulin的線性范圍<10μg。

看家蛋白的表達(dá)差異不僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在骨骼、脂肪和內(nèi)部器官在內(nèi)的多種組織中，都能檢測(cè)到看家蛋白的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在心臟和脾臟組織之間觀察到了β-actin表達(dá)差異最為明顯。在幾乎相同的蛋白上樣量的實(shí)驗(yàn)條件下，β-actin表達(dá)量出現(xiàn)了明顯的差異表達(dá)，如果這些實(shí)驗(yàn)均使用β-actin作為看家蛋白歸一化，引入的誤差可能相差20%以上。因此，研究結(jié)果和期刊雜志都建議使用總蛋白表達(dá)量作為蛋白上樣量的指標(biāo)，從而對(duì)多種組織和實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較和分析。

圖2. β-actin表達(dá)的比較分析在廣泛的組織中變化很大。A.評(píng)估β-actin表達(dá)的組織樣品的代表性圖像。 從左到右：肌肉（腓腸?。?，心臟，骨骼（股骨），顱骨，脾臟和脂肪（性腺）。 比例尺= 1 cm。 B. 定量WB實(shí)驗(yàn)顯示了肌肉，心臟，骨骼，顱骨，脾臟和脂肪提取物中的β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)（綠色）存在很大差異。 總蛋白染色凝膠圖像（紅色）覆蓋在作為對(duì)照。 C.對(duì)于不同分子量范圍的總蛋白質(zhì)測(cè)量結(jié)果表明，在不同組織樣品中蛋白質(zhì)上樣的準(zhǔn)確性。 D.堆疊的條形圖，顯示了所檢查的每個(gè)組織的β-actin（綠色條）和總蛋白質(zhì)測(cè)量值（紅色條）的比較變異性。

圖4. （左圖）AzureRed與三種目標(biāo)蛋白質(zhì)同時(shí)成像。 在Azure成像系統(tǒng)上成像。 （右圖）與普通管家蛋白相比，AzureRed具有更寬的線性動(dòng)態(tài)范圍。

Azure Biosystem公司的AzureRed總蛋白染色，對(duì)Western Blot實(shí)驗(yàn)流程造成最小干擾的情況下，研究者可以輕松地對(duì)總蛋白進(jìn)行染色和歸一化。在定量檢測(cè)WB實(shí)驗(yàn)中，明顯優(yōu)于常規(guī)的看家蛋白，高重復(fù)性，寬動(dòng)態(tài)范圍，使得AzureRed總蛋白染色非常適合研究人員進(jìn)行中蛋白歸一化。

簡(jiǎn)單—AzureRed是可逆的染料，與基于下游抗體的檢測(cè)兼容
一致—AzureRed發(fā)出的信號(hào)可再現(xiàn)，不受組織類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)條件的影響
準(zhǔn)確—AzureRed在寬動(dòng)態(tài)范圍（> 3 logs）內(nèi)呈線性，可實(shí)現(xiàn)可靠的定量
靈活— AzureRed可與熒光標(biāo)記的抗體以及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)一起使用

Azure Biosystems通過(guò)高性能的成像系統(tǒng)，分析軟件和高靈敏試劑，提供一致的Western Blot實(shí)驗(yàn)流程。成像系統(tǒng)為您提供研究所需的靈活性，定量Western Blot解決方案幫助您更好的完成實(shí)驗(yàn)。

● 雙激光近紅外——近紅外采用激光光源，激發(fā)強(qiáng)度大，單色性好，減少光泄露，圖像信噪比高。

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● 四通道熒光同時(shí)成像——可同時(shí)在一張印膜上檢測(cè)4種蛋白，無(wú)需剝離和二次孵育。

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